Sự nhân đôi và sửa chữa DNA

Nguyên lý cơ bản của quá trình nhân đôi DNA

• Mục đích: quá trình sao chép DNA chuỗi kép trong pha S của chu kỳ phân bào, đảm bảo truyền đạt thông tin di truyền giống hệt nhau từ tế bào mẹ sang tế bào con.
• Nhân đôi DNA:
  • Có tính bán bảo toàn: Quá trình nhân đôi tạo ra hai phân tử DNA chuỗi kép giống hệt nhau, trong đó mỗi phân tử mới bao gồm một mạch mẹ (đóng vai trò là mạch khuôn) và một mạch con mới được tổng hợp.
  • Diễn ra theo chiều 5′ → 3′
  • Có tính hai chiều:
    • Quá trình nhân đôi diễn ra đồng thời trên cả hai mạch của DNA chuỗi kép ban đầu theo hai hướng ngược nhau (tức là theo chiều 5′→ 3′ của mỗi mạch mẹ).
    • Hai chạc sao chép hoạt động được hình thành tại vị trí tách chuỗi kép DNA.
  • Bắt đầu tại nhiều điểm
  • Diễn ra trong ba giai đoạn :
    • Khởi đầu (Xem “Quá trình nhân đôi DNA” ở phần dưới đây.)
    • Kéo dài
    • Kết thúc

Các protein tham gia vào quá trình nhân đôi DNA

Protein		Chức năng		Enzyme ở sinh vật nhân sơ	Enzyme ở sinh vật nhân thực
Helicase		Tháo xoắn các đoạn cục bộ của chuỗi xoắn kép DNA tại chạc sao chép Phản ứng phụ thuộc ATP		DnaB	Phức hợp duy trì nhiễm sắc thể nhỏ (MCM)
Protein gắn DNA sợi đơn (SSB)		Ngăn cản sự tái kết hợp của các sợi đã tách rời		SSB	Protein sao chép A (RPA)
Topoisomerase	Topoisomerase I	Loại bỏ các siêu xoắn hình thành trong quá trình kéo dài DNA khi DNA mẹ bị tách bởi helicase.	Chỉ cắt một trong hai sợi DNA Có hoạt tính nuclease để cắt các sợi DNA Và có hoạt tính ligase để nối lại sợi đã cắt Không yêu cầu ATP	Topoisomerase I (topoisomerases IA)	Topoisomerase I (topoisomerases IB) Bị ức chế bởi các thuốc hóa trị irinotecan và topotecan Các kháng thể anti-Scl-70 (xuất hiện ở nhiều cá nhân bị xơ cứng bì) nhận diện topoisomerase I là kháng nguyên của chúng.
	Topoisomerase II		Cắt cả hai sợi DNA để tạo ra những thay đổi cấu trúc lớn hơn của DNA Yêu cầu ATP	Topoisomerase II (DNA gyrase) và topoisomerase IV Cả hai enzyme đều bị ức chế bởi một số kháng sinh (ví dụ: nhóm quinolone, ciprofloxacin)	Topoisomerase II: bị ức chế bởi các thuốc hóa trị etoposide và teniposide
Primase (RNA polymerase phụ thuộc DNA)		Tổng hợp các đoạn RNA mồi ngắn		Primase (DnaG)	Hoạt tính primase như một thành phần của DNA polymerase α
DNA polymerase phụ thuộc DNA		Kéo dài các đoạn mồi RNA bằng cách thêm 50–100 nucleotide		N/A	Polymerase α
		Sao chép sợi chậm (lagging strand)		DNA polymerase III: bị ức chế bởi một số thuốc (ví dụ: thuốc kháng retrovirus) thông qua cơ chế kết thúc chuỗi (nhóm 3′-OH biến đổi của thuốc ngăn chặn sự kéo dài thêm của chuỗi nucleotide)	Polymerase δ
		Kéo dài sợi dẫn (leading strand) (cho đến khi chạm tới mồi của đoạn trước đó) Hoạt tính tổng hợp 5′→3′ Hoạt tính exonuclease đọc sửa 3′→5′			Polymerase ε
		Loại bỏ các đoạn mồi (bằng cách thay thế chúng bằng một đoạn DNA)		RNase H và DNA polymerase I (hoạt tính exonuclease 5′→3′ → loại bỏ mồi RNA)	RNase H và FEN-1 (flap endonuclease-1)
		Các khoảng trống giữa các đoạn được lấp đầy sau khi loại bỏ mồi		DNA polymerase I Hoạt tính exonuclease 5′→3′ để loại bỏ mồi RNA Hoạt tính exonuclease 3′→5′ để đọc sửa sợi đã tổng hợp	Polymerase δ
Ligase		Nối các đoạn DNA mới tổng hợp (các đoạn Okazaki) bằng cách xúc tác hình thành các liên kết phosphodiester Phản ứng phụ thuộc ATP hoặc NAD+		DNA ligase	DNA ligase
Telomerase		Một enzyme phiên mã ngược (DNA polymerase phụ thuộc RNA) Thêm các trình tự lặp lại của DNA (TTAGGG) vào đầu 3′ của các nhiễm sắc thể dạng sợi Ngăn ngừa sự mất vật chất di truyền		N/A đối với vi khuẩn (sinh vật nhân sơ có nhiễm sắc thể dạng vòng và không yêu cầu telomerase)	Telomerase Thường tăng biểu hiện trong các tế bào u → tăng trưởng quá mức

Helicase chia DNA thành hai nửa. Ligase nối các đoạn Okazaki!

Quá trình nhân đôi DNA

Giai đoạn khởi đầu

1. Điểm khởi đầu sao chép (ori): một trình tự DNA đặc hiệu trong bộ gene nơi quá trình nhân đôi DNA bắt đầu
   • Các protein đặc hiệu (tạo thành phức hợp tiền khởi đầu) nhận diện và gắn vào điểm khởi đầu sao chép.
   • Điểm khởi đầu sao chép chứa các trình tự giàu AT (ví dụ: các vùng hộp TATA), tương tự như các trình tự tìm thấy trong vùng khởi động (promoters)
   • Sinh vật nhân sơ với bộ gene dạng vòng chỉ có một điểm khởi đầu duy nhất.
   • Sinh vật nhân thực có nhiều điểm ori (ví dụ: 30.000–50.000 ở người), nơi quá trình nhân đôi DNA bắt đầu đồng thời.
2. Chạc sao chép: vùng hình chữ Y trong nhiễm sắc thể, nơi cả mạch dẫn đầu và mạch theo sau đều được tổng hợp từ mạch khuôn DNA
   • Helicase tách và bắt đầu tháo xoắn DNA chuỗi kép thành các chuỗi đơn tại ori, tạo thành hai chạc sao chép.
   • Quá trình nhân đôi diễn ra đồng thời trên cả hai mạch (hai chiều), nhưng luôn theo chiều 5′ → 3′.
3. Ngăn chặn sự tái bắt cặp: các protein gắn chuỗi đơn (SSBs) ngăn cản các chuỗi đơn tái bắt cặp và bảo vệ DNA chuỗi đơn khỏi bị phân cắt.
4. Giải tỏa siêu xoắn: các DNA topoisomerase giải tỏa hiện tượng xoắn quá mức (siêu xoắn dương) hoặc xoắn không đủ (siêu xoắn âm) phát sinh trong quá trình tách và kéo dài DNA.

Giai đoạn kéo dài

1. Tổng hợp mồi
   • Mồi RNA: một trình tự RNA dài 10–12 nucleotide bổ sung với mạch khuôn
     • Được tổng hợp bởi RNA primase
     • Cung cấp nhóm 3′-OH để các DNA polymerase có thể gắn nucleotide DNA vào.
   • Mồi RNA sẽ được loại bỏ ở giai đoạn sau.
2. Tổng hợp DNA: Để nhân đôi đồng thời cả hai mạch mẹ, quá trình nhân đôi DNA diễn ra liên tục trên mạch dẫn đầu và không liên tục trên mạch theo sau theo chiều 5′→3′. Đồng thời, các deoxynucleotide bổ sung được thêm vào nhóm 3′-OH tự do của mạch con.
   • Phản ứng được xúc tác bởi DNA polymerase (polymerase δ ở sinh vật nhân thực, DNA polymerase III ở sinh vật nhân sơ)
     • Hoạt tính DNA polymerase 5′→3′ xúc tác cho cuộc tấn công nucleophilic của nhóm 3′-OH vào α-phosphate của deoxynucleotide triphosphate sắp đi vào, tạo thành liên kết ester.
     • Các chuỗi DNA được kéo dài từng nucleotide một.
     • Giải phóng pyrophosphate (PP_i).
     • Pyrophosphate bị phân cắt thành hai phosphate bởi pyrophosphatase.
   • Mạch dẫn đầu: một mạch con bổ sung của DNA có quá trình nhân đôi liên tục nhờ có đầu 3′-OH tự do
     • Đầu 3′-OH tự do ban đầu nằm trên mồi.
     • Chỉ cần một mồi duy nhất.
   • Mạch theo sau: một mạch con bổ sung của DNA có quá trình nhân đôi không liên tục vì các mồi RNA mới liên tục được tổng hợp tại chạc sao chép đang di chuyển để đảm bảo có đầu 3′-OH tự do cho quá trình kéo dài
     • Đoạn Okazaki: các đoạn không liên tục dài 1.000–2.000 nucleotide phát sinh trong quá trình tạo mạch theo sau
       • Mỗi đoạn DNA yêu cầu một mồi RNA riêng.
       • Mỗi mồi được tổng hợp tại chạc sao chép đang di chuyển.
3. Đọc soát: Một số polymerase (ví dụ: DNA polymerase I và III) có hoạt tính exonuclease 3′→5′ để đọc soát DNA vừa được tổng hợp và loại bỏ các nucleotide bắt cặp sai.
4. Loại bỏ mồi:
   • DNA polymerase I và δ có hoạt tính exonuclease 5'→3' cho phép enzyme loại bỏ mồi RNA.
   • Ở sinh vật nhân sơ, mồi được loại bỏ bởi RNase H và hoạt tính exonuclease 5′→3′ của DNA polymerase I. Ở sinh vật nhân thực, mồi RNA bị thay thế bởi DNA polymerase δ và bị cắt bỏ bởi enzyme FEN-1 (flap endonuclease-1)
5. Lấp đầy các khoảng trống: Trong quá trình loại bỏ mồi, DNA polymerase lấp đầy các khoảng trống bằng các deoxynucleotide bổ sung với mạch mẹ cho đến khi các đầu tự do gặp nhau.
   • Ở sinh vật nhân sơ, DNA polymerase I thay thế mồi RNA bằng cách thêm từng deoxynucleotide và thực hiện đọc soát khi làm vậy.
   • Ở sinh vật nhân thực, polymerase δ thay thế mồi RNA.
     • DNA ligase nối (ligate) các đầu tự do của các đoạn Okazaki, tạo thành một chuỗi DNA liên tục.
     • Phản ứng của Ligase
       • DNA ligase chuyển một gốc AMP đến đầu phosphate 5′ của một trong các đoạn DNA cần nối.
       • AMP bị phân cắt và đầu phosphate 5′ gắn vào đầu 3′-OH của đoạn kia.

Giai đoạn kết thúc

• Được khởi đầu bằng việc các protein kết thúc gắn vào các trình tự kết thúc
• Có nhiều cơ chế kết thúc khác nhau cho các phân tử DNA dạng vòng và dạng tuyến tính (ví dụ: một trình tự vị trí kết thúc trong DNA).

Các chất ức chế nhân đôi DNA có đầu 3′-OH bị biến đổi, ngăn cản sự kéo dài của chuỗi nucleotide hiện có, hiện tượng này còn được gọi là “chấm dứt chuỗi” (chain termination).

• Cấu trúc: đoạn DNA không mã hóa gồm vài nghìn cặp base (bao gồm các trình tự lặp lại nối tiếp TTAGGG) tại đầu 3′ của nhiễm sắc thể
• Chức năng
  • Ngăn ngừa sự mất gen cấu trúc trong quá trình nhân đôi các chuỗi xoắn kép DNA tuyến tính
    • Mạch chậm ngắn dần sau mỗi chu kỳ nhân đôi DNA.
      • DNA polymerase không thể tổng hợp phần cuối của đầu 5′ trên mạch chậm vì không có nhóm 3′-OH để lấp đầy các khoảng trống sau khi loại bỏ mồi RNA.
      • Một phần của telomere bị mất thay vì mất đoạn mã hóa của DNA.
    • Mạch dẫn có thể được tổng hợp hoàn toàn.
  • Telomere ngăn chặn sự mất nucleotide liên tục từ đầu 3′ của DNA trong quá trình nhân đôi, từ đó làm tăng số chu kỳ nhân đôi tối đa mà một tế bào có thể thực hiện.
• Duy trì bởi telomerase: một loại enzyme phiên mã ngược mang theo khuôn RNA của riêng nó (ribonucleoprotein) và có khả năng kéo dài telomere
  • Chỉ có ở các tế bào nhân thực (đặc biệt là trong các tế bào phân chia nhanh như tế bào gốc)
  • Hoạt tính tăng cao trong các tế bào ung thư
  • Thêm một polymer DNA (TTAGGG) để tránh mất vật chất di truyền từ đầu 3′ của chuỗi DNA sau mỗi lần nhân đôi

Để ghi nhớ trình tự TTAGGG được thêm vào bởi telomerase: Tell Them All: Genes Gotta Go! (Hãy nói với tất cả họ: Gen phải ra đi!)

Có các nguồn gây tổn thương DNA nội sinh hoặc ngoại sinh, những tổn thương này có thể dẫn đến đột biến và/hoặc chết tế bào nếu không được sửa chữa.

Nguồn gây tổn thương DNA nội sinh

• Sai sót trong sao chép
  • Các trình tự lặp lại: DNA polymerase dễ xảy ra sai sót khi đọc các trình tự DNA lặp lại. Vùng lặp lại bị đọc đi đọc lại nhiều lần, đặc biệt là trong các trình tự lặp bộ ba.
  • Sự chuyển vị tautomer keto-enol: một sự dịch chuyển tautomer tạm thời của các base nucleotide từ cấu hình keto thông thường sang cấu hình enol, điều này có thể dẫn đến ghép cặp base sai (ví dụ: enol-thymine ghép cặp với guanine thay vì adenine)
• Sự mất ổn định hóa học
  • Sự mất purine (depurination): sự phân cắt do nhiệt của liên kết N-glycosidic giữa deoxyribose và một base purine ở nhiệt độ cơ thể
    • Một vị trí mất purine/pyrimidine (vị trí AP) được hình thành.
    • Vị trí AP là một trong những tổn thương DNA xảy ra phổ biến nhất về mặt sinh lý (ước tính > 10.000 vị trí/ngày trên mỗi tế bào ở sinh vật nhân thực).
  • Tổn thương do gốc tự do: các gốc oxy hoặc hydroxyl có hoạt tính cao gây ra stress oxy hóa và có thể làm thay đổi hóa học của các base
    • Ví dụ: guanosine chuyển thành 8-oxoguanosine
    • Kết quả: Trong quá trình sao chép, 8-oxoguanosine ghép cặp với adenine thay vì cytosine.
  • Sự khử amin tự phát của các base DNA gây ra ghép cặp base sai (mismatching)
    • Sự khử amin của cytosine thành uracil (ví dụ: do hấp thu nitrite từ thực phẩm), sau đó uracil ghép cặp với adenine
      • Uracil thường được nhận diện là một sai sót và được thay thế bằng cytosine thông qua cơ chế sửa chữa cắt bỏ base.
      • Nếu điều này không xảy ra, trong lần sao chép tiếp theo, uracil sẽ ghép cặp với adenine thay vì guanine ghép cặp với cytosine.
    • Sự khử amin của 5-methylcytosine thành thymine, sau đó thymine ghép cặp với adenine thay vì guanine.
    • Sự khử amin của adenine thành hypoxanthine
    • Sự khử amin của guanine thành xanthine

Nguồn gây sai sót DNA ngoại sinh

• Các chất độc hại
  • Các chất alkyl hóa
    • Cơ chế tác dụng: methyl hóa hoặc ethyl hóa các base gây ghép cặp base sai, ví dụ: O⁶-ethylguanine được hình thành do sự alkyl hóa guanine và ghép cặp với thymine thay vì cytosine.
    • Ví dụ: khí mustard, N-nitrosodimethylamine, dimethyl sulfate
  • Các chất xen cài
    • Cơ chế tác dụng: xen vào giữa các cặp base DNA xếp chồng, khiến quá trình sao chép bị dừng lại và làm tăng nguy cơ đứt gãy sợi
    • Ví dụ: ethidium bromide, thuốc nhuộm acridine, dactinomycin
• Bức xạ
  • Bức xạ tia cực tím (cả UVA và UVB) có thể dẫn đến hình thành dimer của các base pyrimidine lân cận (dimer pyrimidine)
    • Chủ yếu hình thành các dimer thymine, liên kết bởi một vòng cyclobutane
    • Các dimer tạo ra sự biến dạng xoắn lớn gây cản trở quá trình sao chép DNA, khiến quá trình sao chép dừng lại sớm, làm tăng nguy cơ xảy ra các đột biến tiếp theo (ví dụ: đột biến gen BRAF trong u hắc tố).
  • Bức xạ ion hóa
    • Chủ yếu gây đứt gãy sợi đôi DNA (dsDNA breaks), nhưng cũng có thể gây đứt gãy sợi đơn DNA (ssDNA breaks)
    • Đồng thời dẫn đến tăng hình thành các gốc tự do

Loại sửa chữa DNA	Pha của chu kỳ tế bào	Cơ chế	Liên quan khi sửa chữa bị khiếm khuyết
Sửa chữa DNA sợi đơn (ssDNA)
Sửa chữa cắt bỏ base	Xuyên suốt chu kỳ tế bào	Glycosylase đặc hiệu cho base (DNA glycosylase) nhận diện và loại bỏ các base bị tổn thương (ví dụ: bị khử amin hoặc oxy hóa), tạo ra một vị trí AP (apurinic/apyrimidinic). AP endonuclease cắt khung xương DNA ở đầu 5′ của vị trí AP. AP lyase cắt khung xương DNA ở đầu 3′ của vị trí AP. DNA polymerase-β lấp đầy khoảng trống. Ligase nối lại sợi DNA.	Sửa chữa quá trình khử amin tự phát hoặc do độc chất Một số bệnh ung thư, ví dụ: ung thư đại trực tràng (MBD4), ung thư dạ dày (NEIL1)
Sửa chữa cắt bỏ nucleotide	Pha G1	Các endonuclease đặc hiệu nhận diện vùng bị tổn thương (ví dụ: pyrimidine dimer làm biến dạng xoắn kép DNA) của các nucleotide (thường là một đoạn từ 12–24 bp). Đoạn oligonucleotide chứa vùng bị tổn thương được cắt bỏ bởi endonuclease. DNA polymerase lấp đầy khoảng trống vừa tạo ra. Ligase nối lại sợi DNA.	Bệnh sạm da do ánh sáng (bức xạ UV gây hình thành các pyrimidine dimer)
Sửa chữa sai sót DNA	Pha S	Sợi mới tổng hợp (sợi chưa methyl hóa) được phân biệt với sợi mẹ đã methyl hóa Các cặp base bị bắt cặp sai được nhận diện bởi các protein MSH. Sợi bị tổn thương bị cắt bởi endonuclease. Các nucleotide bị tổn thương bị loại bỏ bởi exonuclease. DNA polymerase lấp đầy khoảng trống vừa tạo ra (không làm mất vật chất DNA). Ligase nối lại sợi DNA.	Ung thư đại trực tràng di truyền không đa polyp
Sửa chữa đứt gãy DNA sợi đôi (dsDNA)
Nối đầu không tương đồng	Xuyên suốt chu kỳ tế bào	DNA bị đứt gãy sợi đôi được sửa chữa thông qua DNA ligase IV. Các trình tự tương đồng ngắn, gọi là microhomologies, tạo nên các đuôi sợi đơn của các đầu DNA cần được nối. Quá trình sửa chữa thường chính xác nếu các microhomologies tương thích Bản thân cơ chế nối đầu không tương đồng dễ xảy ra sai sót và gây ra các khiếm khuyết đột biến vì không có khuôn mẫu chính xác. Một số đoạn DNA có thể bị mất hoặc chuyển đoạn trong quá trình này.	Hội chứng thất điều - giãn mạch
Sửa chữa tái tổ hợp tương đồng	Cuối pha S hoặc pha G2	Sửa chữa bằng cách trao đổi các đoạn tương đồng giữa hai phân tử DNA (chromatid chị em) Sai sót có thể được sửa chữa bằng cách sử dụng sợi bổ sung từ chromatid chị em còn nguyên vẹn. Yêu cầu một trình tự (gần như) giống hệt (chẳng hạn như sợi bổ sung) để làm khuôn mẫu cho việc sửa chữa Không có DNA bị mất trong quá trình này.	Ung thư vú/ung thư buồng trứng (do đột biến BRCA1 và BRCA2) Thiếu máu Fanconi

Các enzyme trong cơ chế sửa chữa cắt bỏ bazơ: GEL PLease = Glycosylase, AP-Endonuclease, Lyase, DNA Polymerase, DNA Ligase

Sửa chữa cắt bỏ xảy ra trong pha G1 của chu kỳ tế bào. Sửa chữa sai sót DNA xảy ra trong pha S của chu kỳ tế bào.